技术与支持

SUPPORT

细胞表面染色

细胞准备:
1. 采集组织(peizang,淋巴结,胸腺和骨髓),用细胞染色buffer制成单细胞悬液。对于体外刺激的细胞,直接将刺激后的细胞悬浮于细胞染色buffer中。
2. 加入细胞染色buffer至15 mL, 350×g 离心细胞悬液5分钟,弃上清。

红细胞裂解:
3. 如果需要裂解红细胞(如peizang),将10×红细胞裂解液(RBC)用H2O稀释为1×RBC,放置到室温。将细胞重悬于3 mL 1×RBC中,室温孵育5分钟。
4. 加入10 mL细胞染色buffer终止红细胞裂解,350×g 离心细胞悬液5分钟,弃上清。
5. 重复洗涤一次,同步骤2。
6. 细胞计数,用细胞染色buffer将细胞制成1×107个/mL悬液。取100 μL细胞悬液加入流式管中备用。

封闭Fc受体:
7. 封闭Fc受体能减少染色过程中的非特异性染色。小鼠中,纯化的CD16/CD32单抗能和FcγRⅢ/Ⅱ结合,封闭非特异性染色。加入5-10 μg/mL FcγRⅢ/Ⅱ封闭液,冰上孵育10分钟。

细胞染色:
8. 按照说明书的推荐用量加入荧光标记的抗体,混匀后置于冰上,避光孵育30分钟。
9. 加入5mL FACs buffer重悬细胞,350×g 离心细胞悬液5分钟,弃上清。
10. 加入0.5mL FACs buffer重悬细胞,用流式细胞仪进行检测和分析。

注意事项:
1. 抗体使用前,建议快速甩动一下,使之聚集到管底;
2. 荧光标记的抗体应于4℃避光保存,请勿冷冻;
3. 样品经多聚甲醛固定或染色后延迟分析可能降低某些抗体的荧光信号。为了得到更好的结果,建议染色后尽快上机检测。
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下一章:iFlour荧光染料介绍发布时间: 2015-12-18