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Annexin V测细胞凋亡

实验原理：

Annexin V是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的细胞膜结合，是检测早期细胞凋亡的灵敏指标之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸由质膜内侧向外侧翻转。Annexin V与磷脂酰丝氨酸具有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，以此与DNA碎片检测比较，使用Annexin V可以更早的检测到凋亡细胞。由于细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料（如PI或7-AAD）合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-)与死亡细胞（Annexin V+/核酸染料+）。利用流式细胞术，通过检测单个细胞荧光标记的Annexin V和核酸染料的信号强度，即可判断细胞凋亡状态。

操作步骤：

1. 收集细胞（数目约1×106个/样品），500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。

2. 加入1 mL PBS缓冲液重悬细胞，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去PBS。

3. 加入1*Binding Buffer缓冲液制成1*106个细胞/mL的悬液。

4.取100 μL细胞悬液于新的试管中，加入Annexin V (5 μL)，轻轻混匀，室温避光孵育10分钟，再加入PI染料(5 μL)，室温避光孵育5分钟。对照及待测样品设置参考如下：

管号	名称	Annexin V	PI
1	阴性对照	-	-
2	单阳性对照1	+	-
3	单阳性对照2	-	+
4	待测样品	+	+

5. 加入PBS缓冲液至终体积为500 μL。轻轻混匀，1小时内上机检测。

结果分析举例：

如图所示，Annexin V+/PI-（第四象限）即为凋亡细胞，Annexin V+/PI+（第一象限）为死亡细胞，Annexin V-/PI-（第三象限）为正常细胞。

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下一章：糖化血红蛋白HbA1c快速检测方法简介发布时间： 2015-12-16