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荧光抗体染色常见问题及解决方案
无法标记细胞 1、抗体是否正确保存(4℃避光保存);
2、抗体是否超过使用期限;
3、样品中是否加入了正确的抗体(一抗或二抗);
4、确保抗体结合了荧光物质。如果抗体未结合荧光染料,确保使用了适当的荧光标记二抗;
5、确保二抗有活性——是否曾与其它一抗联合使用?
6、使用的二抗是否能识别所用一抗;
7、PE或APC标记的抗体,确保产品未冷存;
8、确定样品是否表达要检测的抗原。建议设一组已知表达该抗原的样品作为阳性对照;
9、样品种属与抗体是否匹配。
10、确保使用正确波长的激发光及正确的分析通道。
荧光强度弱 1、是否过度稀释抗体。请按照说明书正确稀释抗体;
2、间接染色中造成弱阳性的原因可能是前带效应,即高浓度抗体聚集阻碍特异性抗体和抗原的结合,可能会引起弱的染色结果。解决方法:稀释抗体;
3、细胞数过多也会引起弱阳性结果。调整细胞至说明书建议密度;
4、可能与抗原表达情况有关。请检查相关文献以确定抗原表达水平;若抗原表达弱,请选择荧光强度高的荧光标记抗体;
5、使用有交叉反应的抗体比特异性抗体更易出现弱阳性结果;
6、优化一抗和二抗的孵育时间及温度。
非特异性染色 1、非特异性染色,可能是由于自发荧光引起的。解决方法:在同样的检测条件下,加入空白细胞对照,可得出细胞自发荧光的水平。
2、选择CD16/32抗体(产品编号:M10161)封闭Fc受体,可减少抗体和细胞的非特异性结合。
3、可能是使用二抗引起的非特异性染色。请选择与检测组织没有交叉反应的二抗。
4、染色后是否充分洗涤。
5、降低抗体浓度,可减少非特异性染色。
同一抗体,PE标记染不上,FITC标记的染色结果良好
1、PE标记的抗体是否被冷存。如果是此种情况,建议购买新抗体;
2、可能是多聚甲醛固定引起的问题。请使用现配的多聚甲醛或将细胞处理后不经固定尽快分析。
散射信号异常
1、尽可能使用新鲜的细胞。散射光信号会显示出死细胞和